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一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法

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发表于 2014-7-13 15:55:14 | 显示全部楼层 |阅读模式
CN 103289967 A 摘要 本发明公开了一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法,它采用A、B、C、D、E五个工艺步骤完成,其中在B步骤中加入海澡糖,在C步骤中加入浓度为3~5%硅酸钠或盐酸的水溶液,在D步骤中加入pH为9.0的碳酸氢钠缓冲溶液;用该工艺生产的超氧化物歧化酶的产品活性达3000U/mg以上,同批次产品误差小于3%,而且该产品用于下游产品开发再经过第二次加工后,酶的结构稳定性、活性保存率仍然可以达到93%以上,且常温保存可达三年以上,食用安全性和稳定性均优于其它植物中提取的超氧化物歧化酶。
  权利要求(1)
     
      1.一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法,它采用A、B、C、D、E五个工艺步骤完成;  A步骤:挑选神州草鲜草的茎叶部分清洗,加水精磨连续打浆压汁处理得到植物浆液的细浆,在植物浆液中加酸固液分离,得到上清液;将上清液用活性碳过滤,滤掉部分杂质、色素、无机盐及其它小分子蛋白,得到粗酶溶液;  B步骤:向粗酶溶液配制海澡糖混合加热37°C至15min,制成酶溶液,其粗酶溶液与海澡糖的比例为(5:1),置静冷却后将该溶液中加入30%氯仿-酒精混合液进一步去杂,然后通过精过滤得到浓缩的无色透明体酶溶液,其特征在于海澡糖的作用是在加热过程中对酶蛋白分子能形成独特的保护膜,并激活酶蛋白金属离子的活性,有效地保护大分子蛋白质分子不变性失活、增强酶溶液的浓度和提高蛋白水解酶的稳定性;  C步骤:向浓缩酶溶液中加入浓度为3?5%硅酸钠或盐酸的水溶液,使水溶蛋白质沉淀固定化,硅酸钠或盐酸作为酶蛋白的固定化沉淀剂,与丙酮和硫酸铵沉淀剂相比,沉淀时间可缩短30%,且沉淀效果好、速度快能性成本低且不损伤水溶性蛋白活性,其特征在于钠离子或盐酸使水溶性酶蛋白固定化从而与水分离的作用;  D步骤:向固定化后的酶蛋白静置处理去掉上层的清水,然后用去离心水加乙醇进多次洗涤杀菌,精制得到超氧化物歧化酶乳液;  E步骤:向精制的超氧化物歧化酶乳液进行凝胶层析装置分级提纯,然后用3 -环糊精醛基衍生物冻干粉配制pH为9.0的碳酸氢钠缓冲溶液溶解,对酶分子进行修饰;得到的产物为IBX-P-CD-SOD,其特征在于¢-环糊精具有独特的外部亲水、内部疏水的分子结构;一方面:保护了酶分子周围微环境,减少酶分子之间的碰撞次数,从而增加了酶的稳定性;另一方面环糊精独特的亲水结构提高了 IBX-P-CD-SOD的亲水性,从而提高了IBX- ^ -CD-SOD的稳定性,再经冷冻升华干燥等常规工艺即可得到晶体的超氧化物歧化酶纯品。·
   
    说明
    一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法[0001]        技术领域:本发明专利涉及一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法,另涉及从植物的茎叶中提取超氧化物歧化酶的方法。[0002]        背景技术:超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,英文缩写S0D)广泛存在于生物体内,是具有生物活性的一类防御氧化损伤(抗氧化)的金属酶蛋白,也是目前为止所发现的唯一的以 02-为底物的酶,能催化细胞内超氧化物阴离子(02-)的歧化反应,使02-转化为H202 和02。超氧化物歧化酶是超氧阴离子自由基(0.-)2的专业清除剂,能有效预防治疗由其引发的相关疾病的作用;具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗炎症、增强人体免疫的功能,被誉为人体垃圾清道夫。目前医学美容或医学临床方面主要用于延缓人体衰老、去除脸面雀斑、 防止色素沉着,并治疗慢性多发性关节炎等对躁郁症发病也起重要的作用,超氧化物歧化酶作为添加剂被广泛地应用于食品及保健食品、日用化妆品、生化制药及酶制剂等领域。[0003]目前,国内外超氧化物歧化酶及其产品大多数是从动物血液和组织中提取的,由于原料有限,成本较高,只限于实验室小批量生产,无法满足产业化需求;因此单纯依赖于从动物血液或其它来源提取的超氧化物歧化酶是永远满足不了市场需求的,尤其是自1997 年欧盟禁止使用动物来源的超氧化物歧化酶,因动物血液来源的超氧化物歧化酶用于临床很有可能携带动物内病毒而对人体健康产生很大的潜在危害,致使从植物中提取超氧化物歧化酶变成为一个很重要的来源。目前植物中提取超氧化物歧化酶有关研究,如沙棘、大豆、玉米、大蒜等,从高等植物中提取超氧化物歧化酶于二十世纪九十年代起开始研究。特别是近年来,国家食品药品监督管理局根据《保健食品注册管理办法(试行)》关于营养素补充剂申报与审评规定中要求申请注册以超氧化物歧化酶为原料生产的保健食品应从天然物质中的可食部分提取,值得深思的是天然的超氧化物歧化酶稳定性差且活性容易损失, 特别是超氧化物歧化酶在进行下游产品开发的第二次加工利用的时候,为了保证产品稳定性,产品活性损失较小、实用性强是提取超氧化物歧化酶首先要考虑到的问题。在目前的相关工艺中某些利用热变性原理的方法,会使酶蛋白分子发生亚基的解聚、变性或其他方面的构象变化,并进而导致酶活性的下降或丧失,产品稳定性差、活性难保存;而且生产工艺存在着使用大量的有机溶剂,并难以回收,提取程序复杂,致使产品的成本较高,生产周期较长,产率不高,故一直停留在实验室阶段,未能形成工厂化生产的规模。[0004]        发明内容: 本发明的目的是提供一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法。[0005]        本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的,一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法,它采用A、B、C、D、E五个工艺步骤完成;A步骤:挑选神州草鲜草的茎叶部分清洗,加水精磨连续打浆压汁处理得到植物浆液的细浆,在植物浆液中加酸固液分离,得到上清液;将上清液用活性碳过滤,滤掉部分杂质、 色素、无机盐及其它小分子蛋白,得到粗酶溶液;B步骤:向粗酶溶液配制海澡糖混合加热37°C至15min,制成酶溶液,其粗酶溶液与海澡糖的比例为(5:1),置静冷却后将该溶液中加入30%氯仿-酒精混合液进一步去杂,然后通过精过滤得到浓缩的无色透明体酶溶液,其特征在于海澡糖的作用是在加热过程中对酶蛋白分子能形成独特的保护膜,并激活酶蛋白金属离子的活性,有效地保护大分子蛋白质分子不变性失活、增强酶溶液的浓度和提高蛋白水解酶的稳定性;
      C步骤:向浓缩酶溶液中加入浓度为3?5%硅酸钠或盐酸的水溶液,使水溶蛋白质沉淀固定化,硅酸钠或盐酸作为酶蛋白的固定化沉淀剂,与丙酮和硫酸铵沉淀剂相比,沉淀时间可缩短30%,且沉淀效果好、速度快能性成本低且不损伤水溶性蛋白活性,其特征在于钠离子或盐酸使水溶性酶蛋白固定化从而与水分离的作用;
      D步骤:向固定化后的酶蛋白静置处理去掉上层的清水,然后用去离心水加乙醇进多次洗涤杀菌,精制得到超氧化物歧化酶乳液;
      E步骤:向精制的超氧化物歧化酶乳液进行凝胶层析装置分级提纯,然后用¢-环糊精醛基衍生物冻干粉配制pH为9.0的碳酸氢钠缓冲溶液溶解,对酶分子进行修饰;得到的产物为IBX-P-CD-SOD,其特征在于¢-环糊精具有独特的外部亲水、内部疏水的分子结构;一方面:保护了酶分子周围微环境,减少酶分子之间的碰撞次数,从而增加了酶的稳定性;另一方面 -环糊精独特的亲水结构提高了 IBX-P -⑶-SOD的亲水性,从而提高了IBX-^-CD-SOD的稳定性,再经冷冻升华干燥等常规工艺即可得到晶体的超氧化物歧化酶纯品。
    [0006]        由于采用上述技术方案,本发明稳定剂采用海澡糖制成的酶溶液,酶溶液固定化采用硅酸钠或盐酸的水溶液,洗涤剂为去离子水加低度乙醇,用层析装置进行层析提纯,修饰剂为¢-环糊精进行修饰。即:原料预处理得到植物浆液,在植物浆液中加酸固液分离,得到上清液,将上清液加热后配制海澡糖的水溶液制成粗酶液,再精过滤去杂得到浓缩酶液,再加溶剂固定化酶 液,使蛋白质沉淀,将沉淀固定化后的酶液离心处理去水后用离子水加低度乙醇洗脱杀菌,得到粗制超氧化物歧化酶,粗酶经凝胶层析装置进行层析和分离,得到超氧化物歧化酶浓缩乳液,经提纯修饰、冷冻升华干燥得到超氧化物歧化酶纯品。具有工艺简单、成本低、提取率高、产能处理量大、超氧化物歧化酶产品的稳定性好、活性高、力口工时间短、且适合工厂化生产特点。经测量,用该工艺生产的超氧化物歧化酶的产品活性达3000U/mg以上,同批次产品误差小于3%,而且该产品用于下游产品开发再经过第二次加工后,酶的结构稳定性、活性保存率仍然可以达到93%以上,且常温保存可达三年以上,食用安全性和稳定性均优于其它植物中提取的超氧化物歧化酶。
    [0007]        具体实施方式:
      下面结合发明内容作进一步说明:
      实施例1:
      取神州香鲜草10kg,80cm?IOOcm茎叶部分清洗,加水精磨连续打浆处理得到细浆,用自制双螺旋压榨机压汁得到植物浆液;植物浆液经无菌高速匀质器处理,加乳酸固液分离得到上清叶,用活性碳粗过滤,除去部分杂质、色素、小分子蛋白等物质得到粗酶溶液。向粗酶溶液配制海澡糖溶液混合加热37°C至15min,比例为(5:1),调节PH=4,冷却静置;将该溶液中加入30%氯仿-酒精混合液进一步去杂,通过板框式过滤机精过滤制得无色透明体超氧化物歧化酶浓缩液13.7L,经测量该浓缩液活性为1382.9u/ml,活性保持为93.62%。浓缩酶溶液加入浓度为3?5%的硅酸钠或盐酸水溶液进行沉淀固定化酶液静置30min后,处理上层的清水,再对固定化酶液先用去离子水进行多次洗涤,然后用浓度为(5:3v/v)乙醇进行梯度洗脱,精制得超氧化物歧化酶乳液7.5L ;经测量该乳液活性为3397.20u/ml, 活性保持率98.31%。向精制的超氧化物歧化酶乳液进行凝胶层析装置分级提纯,然后用 β -环糊精醛基衍生物冻干粉进行修饰得到的产物为ΙΒΧ-β -CD-S0D,用抽滤机除去大部分水分再置入冷冻干燥机中升华干燥成晶体状即为超氧化物歧化酶纯品。[0008]        本发明名称 一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法中所述的神州草是指:神州香、神州菊。
  分类  国际分类号C12N9/02法律事件 日期代码事件说明2013年9月11日C06Publication旋转原始图片
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